Hoe werkt CRISPR/cas9?

Kyle, 17 jaar
23 februari 2019

Het is nogal moeilijk om een duidelijke uitleg te vinden over de (samen)werking van CRISPR en het enzym cas9. Veel artikels gaan namelijk grotendeels over de ethische vragen die deze doorbraak met zich meebrengt. Wat ik al heb gevonden is dat CRISPR een bibliotheek is met delen van het DNA van virussen en cas9 kan gezien worden als een schaar (endonuclease). Wat ik er dus van maak is dat CRISPR een databank is en cas9 eigenlijk al het werk doet bij het veranderen van het DNA. Wanneer een virus een bacterie opnieuw aanvalt, maakt hij een RNA-kopie van het virusDNA dat in het CRISPR zit en geeft het aan het cas9-enzym. het enzym vergelijkt het met het DNA van het aanvallend virus en wanneer hij een match vind, knipt hij het kapot. 1. Kan het cas9 enzym van RNA wisselen/meerdere stukken RNA dragen en vergelijken? 2. Als het cas9 enzym een endonuclease is, wilt dit dan zeggen dat het actief centrum het RNA-deel is? 3. Wat gebeurt er met het "afgeknipte" DNA? wordt het verteerd? 4. Bij de modificatie van DNA wordt het doorgeknipte DNA soms ook weer vervangen. Hoe gaat dit proces dan weer? Ik zit in Latijn-6u wiskunde (1u bio/week) en heb enzymwerking al gezien, als dit helpt bij het opstellen van uw antwoord. Dank bij voorbaat.

Antwoord

CRISPR is in feite de naam voor het afweersysteem tegen bacteriofagen die onderzoekers in het DNA van bepaalde bacterien hebben aangetroffen. "Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats". Het bestaat uit kleine stukjes kopie van stukjes DNA van bacteriofagen waarmee een immuungeheugen wordt gecreeerd. Het afweersysteem bestaat uit een combinatie van 'guideRNA' en CAS9 endonuclease (= een enzym dat DNA doormidden knipt). Het gids-RNA zoekt in het DNA de sequentie op waarmee hij homologie heeft. Het bindt dus alleen met het DNA dat een kopie vormt van zijn eigen sequentie. En vervolgens knipt het CAS9 enzym het DNA op die plaats doormidden. Het gids-RNA en het CAS9 enzym vormen een tandem. Ze binden aan elkaar. En door de binding komt het enzymatisch actieve deel van het CAS9 enzym op de juiste plaats om het DNA doormidden te knippen.

Vraag 1: het CAS9 enzym kan niet verschillende gids-RNAs tegelijkertijd 'dragen'. Er is maar plaats voor één gids-RNA op de bindingsplaats aan het CAS9 enzym. Wel kun je meerdere, verschillende gids-RNAs samen met het CAS9 enzym in een cel brengen. En dan zal op de ene plaats in het DNA het ene gids-RNA met een CAS9 molecule binden en daar knippen en zal op een andere plaats in het DNA het andere gids-RNA met een CAS9 molecule binden en daar het DNA doormidden knippen.

Vraag 2: het CAS9 is inderdaad een endonuclease, maar het is niet het gids-RNA dat het actief centrum vormt. Het gids-RNA bindt met het DNA en associeert met het CAS9 enzym. Vervolgens komt het actief centrum van het endonuclease op de juiste plaats te liggen om het DNA op die plaats doormidden te knippen.

Vraag 3: Als het DNA doormidden geknipt is, heb je een breuk in het DNA zitten. Dat wordt door de cel zelf als schade aan het DNA herkent en vervolgens gaat de natuurlijke, in alle cellen aanwezige DNA-reparatie machinerie aan de slag om die breuk te herstellen. Het DNA wordt dus niet afgebroken of verteerd. Neen. Het wordt juist weer gerepareerd. En voor die reparatie zijn er twee mogelijke routes. Oftewel - en dat is in de meeste gevallen zo - worden de twee uiteinden weer aan elkaar geplakt. In technische termen heet dat 'non-homologous end-joining NHEJ)'. Tijdens dat proces wordt er in veel gevallen een of enkele DNA-lettertjes weggevreten (een 'deletie') of worden er soms een of enkele DNA lettertjes toegevoegd (een 'insertie'). Het eindresultaat is dat de volgorde van het DNA op de plaats waar de knip plaatshad een beetje gewijzigd is. Het heeft een 'mutatie'. Zo'n mutatie betekent heel vaak dat het gen niet meer functioneel is. Een tweede reparatieroute maakt plaats van een 'donor-template': een stuk DNA dat gelijk is aan het stuk DNA waar de knip heeft plaatsgevonden en dat als voorbeeld dient voor de manier waarop de breuk gerepareerd moet worden. Dit wordt 'homology-directed repair (HDR)' genoemd. Je kunt dan ook doelbewust in de donortemplate een of enkele lettertjes wijzigen en op die manier een doelgerichte wijziging van het DNA verkrijgen.

Vraag 4: zie hierboven. Het doorgeknipte DNA wordt niet vervangen, maar gerepareerd. En vaak is het DNA na de reparatie niet meer 100% gelijk aan hoe het voor die tijd was. Er onstaat vaak een mutatie. Wil je zeker weten dat het DNA weer 100% identiek hersteld wordt, dan moet je een donor-template met de juiste sequentie meegeven, en dan moet de reparatie via HDR verlopen.

Reacties op dit antwoord

Er zijn nog geen reacties op deze vraag.

Enkel de vraagsteller en de wetenschapper kunnen reageren op een antwoord.

Beantwoord door

ir René Custers

bioveiligheid, GGO's, wetgeving, risicoanalyse, ethische en maatschappelijke aspecten van de biotechnologie

VIB
Rijvisschestraat 120 9052 Gent
http://www.biotechnologie.be

Zoek andere vragen

© 2008-2025
Ik heb een vraag wordt gecoördineerd door Eos wetenschap. Voor vragen over het platform kan je terecht bij liam.verbinnen@eos.be